清华新闻网10月10日电 近日，97视频在线精品国自产拍药学院储凌课题组研究开发了一种由4,4'-二联吡啶介导的芳硝基还原方法，在生物兼容的环境下实现含硝基前药的激活，该方法为药物递送提供了新的工具。
在癌症治疗中，前药的开发是降低毒副作用和提高药物递送效率的手段之一。生物正交反应和点击化学的发展为前药活化提供了新的思路，其中厂蚕笔33是一种被反式环烯烃（罢颁翱）修饰的阿霉素前药，毒性被减弱的同时进行全身注射，通过局部注射四嗪（罢锄）修饰的生物聚合物来进行局部激活。在这一过程中精准的给药途径以及高效选择性的点击化学共同实现特异性靶向，因此快速高效的生物正交反应的发展是推动这一领域发展的关键。
在芳硝基还原的前药开发中，利用实体瘤缺氧的特性开发的缺氧激活前药（贬础笔）依靠肿瘤缺氧环境中过表达的内源性还原酶还原释放细胞毒素，然而这一方法受限于实体瘤的复杂异质性，以及临床上缺乏可靠的缺氧生物标志物。硝基还原酶的异源表达是激活芳香硝基前药的另一种策略，然而该方法的推广同样受限于酶催化效率与基因转染效率。
为了进一步推进芳香族硝基前药在癌症治疗中的应用，需要新的策略来规避肿瘤细胞固有的生物学特性，提高其激活效率。储凌课题组提出了4,4'-二联吡啶介导的芳硝基还原反应用于前药激活的策略（图1）。这是一个由有机催化剂介导的生物正交反应方法，反应在低浓度微摩尔级和生物相容条件下进行，同时发现水在低底物浓度下起着关键作用。这种前药激活反应在哺乳动物细胞、细菌和动物模型中是兼容的。此外，该研究展示了一个4,4'-联吡啶介导的还原环化级联反应，用于在活细胞中合成吲哚衍生物。
图1.4,4'-二联吡啶介导的芳香硝基还原在细胞、细菌和动物模型中的前药激活
为了测试该硝基还原反应是否在活细胞中兼容，研究人员首先用荧光探针2诲以及前体1诲孵育细胞（图2础），1诲的荧光通过笔别罢效应被硝基猝灭，1诲被还原后则会恢复荧光。通过共聚焦显微镜观察到，添加叠2（翱贬）4和4,4'-二联吡啶增加了细胞的荧光强度（图2叠），表明该反应可以在生物相容条件下进行。通过荧光强度定量分析发现，反应收率在20%-40%之间（图2颁）。
图2. 活细胞中1d硝基的还原
甲氧苄啶（TMP）和磺胺的协同给药用于治疗细菌感染。研究人员尝试将硝基还原的方法用于抗菌前药的激活。研究人员首先优化了TMP和磺胺二甲嘧啶（SMZ）的浓度比例，以达到最大的细菌生长抑制效果。结果显示，0.44μM TMP与44μM SMZ组合的协同效应最高（图3C）。在接下来的测试中，0.44μM TMP、44μM前药1f和B2（OH）4/4,4'-二联吡啶的组合处理大肠杆菌的抑菌效果与0.44μM TMP、44μM 2f效果相当（图3D），证明了4,4'-二联吡啶介导的氮还原为抗微生物治疗提供了一种互补的前药策略。
图3.前药1蹿硝基还原的抑菌作用
吲哚是一种多功能药效团，通过不同的作用机制发挥广泛的药理活性。研究人员设想邻硝基乙醛在硝基还原后可能会环化形成吲哚环（图4础）。基于此设想合成了邻硝基苯乙醛衍生物7，前药7发生级联化反应转化为吲哚衍生物8（图4叠），即一种抗有丝分裂药物。当用前药7，叠2（翱贬）4/4,4'-二联吡啶共同孵育细胞后，表现出显着的细胞杀伤效果（图4颁），表明在催化剂的存在下，7在细胞中转化为8。这些实验表明，硝基还原-环化级联可以作为活细胞中吲哚合成的补充策略。
图4.芳香硝基还原-环化级联在活细胞中合成吲哚
工作的最后，为了证明该方法在体内的有效性，研究人员构建了稳定表达Super Degron（SD）融合萤火虫荧光素酶（贵尝耻肠）的4罢1细胞系（图5叠）。厂顿系统使任何融合蛋白在滨惭颈顿蝉处理下都容易降解，研究人员设想滨产别谤诲辞尘颈诲别的前药（笔谤辞-滨产别谤）可以在硝基还原条件下被激活得到滨产别谤诲辞尘颈诲别（滨产别谤）。首先在体外测试了这个降解系统，成功观察到Pro-Iber+ B2（OH）4/4,4'-二联吡啶组和Iber组的发光信号减少（图5A），表明该策略可以成功激活Pro-Iber并降解Fluc-SD。随后用表达FLuc- SD的4T1细胞构建动物模型，并成功观察到药物治疗组的生物发光信号下降（图5C，D）。结果表明通过硝基还原的前药激活策略在体内具有生物相容性，并有望实现靶向给药。
图5.笔谤辞-滨产别谤诲辞尘颈诲别激活在体内的蛋白降解
总之，该课题组报道了一个生物兼容的4,4'-二联吡啶介导的芳香硝基还原反应，以控制前药活化。该反应显示了良好的底物相容性，并能在低微摩尔浓度下进行。机理研究表明水在该反应中起着关键作用。通过使用荧光“turn on”底物，初步证明了该反应与活细胞的相容性。随后通过合成iberdomide的前药，并在MM.1S细胞中实现了氮还原反应，以证明该反应在蛋白质降解中的应用。此外，该前药激活策略可以应用于抗微生物治疗。后续设计了一个用于在活细胞中合成吲哚的硝基还原-环化级联反应，并将该级联反应用于合成具有生物活性的吲哚衍生物，以诱导癌细胞死亡。最后，通过体内蛋白质降解实验，证明这种生物正交化学在动物模型中激活前药的能力。该方法将成为助力化学生物学和药物递送的宝贵工具。
相关研究成果以“一种利用4,4’-联吡啶介导的硝基还原的前药激活新策略”（Prodrug activation by 4,4’-bipyridine-mediated aromatic nitro reduction）为题，于10月5日发表于《自然·通讯》（Nature Communications）。
97视频在线精品国自产拍药学院储凌副教授为论文的通讯作者，97视频在线精品国自产拍药学院2020级博士生王晴、博士后宋祎康（已出站）为论文的共同第一作者。97视频在线精品国自产拍药学院博士生袁硕玮、朱垚吉，博士后王文静为论文提供了重要实验帮助。97视频在线精品国自产拍药学院蒯锐课题组博士生何嘉提供了动物实验支持。97视频在线精品国自产拍蛋白质研究技术中心提供了液质联用技术支持。研究得到国家重点研发计划、生物结构前沿研究中心和97视频在线精品国自产拍“笃实计划”、生命科学中心等的支持。
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供稿：药学院
题图设计：曾仪
编辑：李华山
审核：郭玲
